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一、實驗目的

1.掌握聚合酶鏈式反應的原理。

2. 掌握移液槍和 PCR 儀的基本操作技術。

二、實驗原理

PCR 技術，即聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）是由美國 PE Cetus 公司的 Kary Mullis 在 1983 年（1993 年獲諾貝爾化學獎）建立的。這項技術可在試管內(nèi)的經(jīng)數(shù)小時反應就將特定的 DNA 片段擴增數(shù)百萬倍，這種迅速獲取大量單一核酸片段的技術在分子生物學研究中具有舉足輕重的意義，極大地推動了生命科學的研究進展。它不僅是 DNA 分析常用的技術，而且在 DNA 重組與表達、基因結構分析和功能檢測中具有重要的應用價值。

PCR 可以被認為是與發(fā)生在細胞內(nèi)的 DNA 復制過程相似的技術，其結果都是以原來的 DNA 為模板產(chǎn)生新的互補 DNA 片段。細胞中 DNA 的復制是一個非常復雜的過程。參與復制的有多種因素。PCR 是在試管中進行的 DNA 復制反應，基本原理與細胞內(nèi) DNA 復制相似，但反應體系相對較簡單。

PCR 由變性 -- 退火 -- 延伸三個基本反應步驟構成：①模板 DNA 的變性：模板 DNA 經(jīng)加熱至 94℃左右一定時間后，使模板 DNA 雙鏈或經(jīng) PCR 擴增形成的雙鏈 DNA 解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應做準備；

②模板 DNA 與引物的退火 (復性)：模板 DNA 經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至 55℃左右，引物與模板 DNA 單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA 模板 -- 引物結合物在 Taq 酶的作用下，以 dNTP 為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板 DNA 鏈互補的半保留復制鏈。

重復循環(huán)變性 -- 退火 -- 延伸三過程，就可獲得更多的 “半保留復制鏈"，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 2～4 分鐘， 2～3 小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

三、實驗試劑與器材

模板 DNA、2.5mmol/L dNTP

Taq DNA 聚合酶（5U/μL）、SSR 引物

10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2O

PCR 儀、移液槍、PCR 板

四、實驗步驟

1、配制 20μL 反應體系，在 PCR 板中依次加入下列溶液：

模板 DNA 2μL

引物 1 1μL

引物 2 1μL

dNTP 1.5μL

MgCl2 2μL

10×buffer 2μL

ddH2O 10μL

Taq 酶 0.5

2、設置 PCR 反應程序。

3、上樣，啟動反應程序。

4、擴增產(chǎn)物的電泳檢測。

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